Structural Study of eIF Complexes by H/D Exchange FT-ICR Mass Spectrometry
Structures de complexes d'initiation de la traduction étudiée par échanges isotopiques couplés à la spectrométrie de masse FT-ICR
Résumé
The eukaryotic initiation factor 3 (eIF3) complex plays a core role in the interaction network among several eIFs that assemble on the 40S ribosomes and participate in the different reactions throughout the translation initiation pathway. The Saccharomyces cerevisiaea eIF3 complex comprises five subunits, all of which are the core subunits of the mammalian eIF3 complex consisting of 13 subunits. Attempts to decipher its tridimensionnal structure are under way. A first path to study the structure of this complex is to complete the identification of binding regions, few of which are currently known. Recently, the interaction region between eIF3i and extreme C-terminal domain of eIF3b has been obtained through NMR and crystal structure. On the other hand, the interaction region between 3i and 3g, although located to the N-terminal domain of 3g still remains to be defined. Hydrogen/deuterium exchanges (HDX) have been developed for a long time and are widely used for structural studies of proteins and multiprotein complexes. It is commonly analyzed using mass spectrometry. The most classic standard HDX-MS approach consists in making a mass measurement of deuterium-labelled peptides from an enzymatic digestion of the protein of interest to determine the level and rate of deuterium incorporation. In this study, a high performance 7 T FT-ICR mass spectrometer was used in combination with nanoLC separation to acquire highly accurate HDX-MS data. The precision on the mass measurement of FT-ICR MS is by itself not sufficient to unambiguously identify peptides from a pepsin digest due to the lack of pepsin specificity. We therefore developed a statistical approach for peptide identification, based on a probability of occurrence value of a given peptide within a pepsin digest. In combination with high mass accuracy, this method allows efficient identification of the peptides, without additional need of MS/MS verification. This method has been applied on the study of the binding regions in the complexes of eIF3i:bC3 and eIF3i:gC1ΔC. Peptide reference lists with high sequence coverage and rich sequence superposition ensured structure elucidation with high spatial resolution. For the binding of 3i and 3b, the detailed interaction regions were unveiled for proteins in the solution phase which resembled the physiological condition and were coherent with the reported protein structure, thus provided complimentary information to the crystallographic structure in solid phase. For the binding of 3i and 3g, the interaction regions were studied with the absence of any atomic structural information of 3g. This provides significant insights of the complex formation of 3i and 3g, and for the first time the precise binding regions were successfully revealed.
Le complexe d'initiation de la traduction 3 des eucaryotes (eIF3) joue un role central dans le réseau d'interaction des divers facteurs d'initiation de la traduction qui s'assemblent sur les ribosomes 40S, et participent aux différentes réactions au cours de la voie d'initiation de la traduction. Chez Saccharomyces cerevisiaea, ce complexe est composé de cinq sous-unités, qui sont toutes homologues avec les sous-unités de cœur du complexe eIF3 des mammifères, composé de 13 sous-unités. Un objectif majeur actuellement est d'obtenir une structure tridimensionnelle de ce complexe. Dans une première étape vers la résolution de cette structure, les efforts portent sur la détermination des régions de liaisons entre sous-unités, dont assez peu sont actuellement connues. La région d'interaction entre la sous-unité 3i et le domaine C-terminal extrémal de 3b a récemment été résolu par RMN et structure cristallographique. D'un autre côté, la région d'interaction entre 3i et 3g, bien que localisée à l'extrémité N-terminale de 3g, doit encore être précisée. Les échanges hydrogène/deutérium (HDX) se sont développés depuis les années 1990 comme outil d'analyse structurale de protéines et de complexes multiprotéiques. La spectrométrie de masse est couramment utilisée pour réaliser la mesure de l'échange. L'approche HDX la plus usuelle repose sur une mesure de masse de peptide marqués issus d'une digestion enzymatique des protéines d'intérêt afin de déterminer le contenu en deutérium ainsi que leur vitesse d'incorporation. Pour ce travail, un spectromètre de masse à ultra-haute résolution, de type FT-ICR 7T, a été utilisé conjointement avec une séparation nano-LC pour générer des données HDX-MS de haute qualité. La précision de mesure de masse d'un spectromètre de masse FT-ICR n'est pas suffisante en elle-même pour identifier de façon certaine les peptides issus d'une digestion à la pepsine, du fait de l'absence de spécificité de la pepsine. Nous avons en conséquence développé une approche statistique pour l'identification des peptides, en se basant sur la définition d'une valeur de probabilité d'occurrence pour un peptide donné dans une digestion à la pepsine. En combinaison avec la précision élevée sur la mesure de masse, ce seul critère permet une identification efficace des peptides, sans devoir recourir à une validation par MS/MS systématique. Cette méthode a été mise en application pour l'étude des régions de liaison dans les complexes eIF3i :b et eIF3i :g. Dans les deux cas, 3i a été surexprimée sous sa forme complète. Au contraire, pour 3b et 3g, seul un segment partiel de la protéine native, contenant le domaine présumé d'interaction a été surexprimé. La liste de référence des peptides présents permet une excellente couverture de séquence et une forte superposition entre séquences adjacentes, ce qui assure une élucidation de la structure avec une bonne résolution spatiale. Pour la liaison entre 3i et 3b, les régions d'interactions qui sont apparues dans des conditions en solution proches des conditions physiologiques sont cohérentes avec la structure proposée par une autre équipe au cours de la thèse, apportant des informations complémentaires à celles issues de la structure cristallographique dérivée de la phase solide. Pour la liaison entre 3i et 3g, la région d'interaction a été étudiée en l'absence de toute donnée structurale à l'échelle atomique pour 3g. Les résultats apportent une vision nouvelle sur la formation du complexe entre 3g et 3i, et pour la première fois les régions de liaisons exacts ont été mis en évidence.