Caractérisation structurale et fonctionnelle de la forme dimérique de la protéine Alix - Groupe Entrée et bourgeonnement des virus à enveloppe / Entry and Budding of Enveloped Viruses Group (EBEV) Access content directly
Theses Year : 2022

Structural and functional studies of dimeric Alix

Caractérisation structurale et fonctionnelle de la forme dimérique de la protéine Alix

Abstract

Cellular membranes are highly dynamic entities that undergo continuous remodeling, including fusion, budding or fission events. Many membrane remodeling processes are catalyzed by the Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT) complexes, which include multivesicular endosomes, cytokinesis, nuclear envelope reformation, membrane repair, autophagy, exosome biogenesis, neuronal pruning, dendritic spine maintenance, enveloped virus budding, release of peroxisomes and of recycling endosomes. Alix (ALG-2 interacting protein-X) is a cytosolic protein that interacts with the ESCRT-1 and ESCRT-III complexes exerting important adaptor functions. Alix is composed of an N-terminal Bro1 domain linked to a central V-shaped coiled-coil domain and a C-terminal proline-rich domain.Alix has been shown to dimerize via its central V-domain, a function necessary for HIV-1 budding. Although structures of the monomeric V-domain and of the Bro-V domain have been solved no high resolution structural information is available on dimeric Alix. Here we solved the structure of the dimeric V domain. The crystal structure reveals that dimerization is achieved by domain exchange. Structure-based mutagenesis studies combined with SAXS analyses further demonstrate the conformational flexibility of Alix. In order to understand the molecular mechanism that leads to dimerization we started structural work on full-length Alix in complex with Alg2 a potential activator of Alix by electron microscopy. Furthermore, we observed in vitro that Alix interacts with membranes in a pH-dependent manner that leads to fusion of liposomes in vitro. This novel activity of Alix may be linked to the fusion of exosomes required for cargo delivery. Together, our work provides first insight into the structural and functional mechanism of Alix dimerization.
Les membranes cellulaires sont des entités hautement dynamiques. Elles subissent au cours du temps, des processus continus de remodelage, de fusion, de bourgeonnement ou de fission. Il a été démontré depuis quelques années que ces processus de remodelage des membranes, incluant entre autres, la formation de vésicules intraluménales, la formation d’endosomes, le bourgeonnement viral, la cytokinèse, la réparation membranaire, l’apoptose des neurones, la formation des pores nucléaires et la réparation de l’enveloppe nucléaire, sont médiés par les composants d'une machine multiprotéique connue sous le nom d’ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport).Alix (ALG-2 interacting protein-X) est une protéine accessoire cytosolique qui est étroitement associée à la fonction des complexes ESCRT. Alix est composée d'un domaine Bro1 N-terminal lié à un domaine central coiled-coil en forme de V et d'un domaine C-terminal riche en proline. Notre laboratoire et d’autres équipes ont montré qu’Alix était capable de dimériser via son domaine V central, fonction nécessaire entre autres pour le bourgeonnement du VIH-1.Dans un premier temps, nous avons résolu la structure du domaine V dimérique. La structure cristalline révèle un échange de domaine du premier protomère avec le second protomère : on parle de « swapp dimer ». Nous avons ensuite réalisé un complexe entre la forme entière de la protéine et de son partenaire Alg-2 et initié le travail de résolution de la structure par microscopie électronique.Enfin, nous avons mis en évidence la faculté de la protéine Alix à déformer les membranes. En effet, nous avons confirmé qu’Alix provoque la fusion des liposomes en condition acide, par plusieurs techniques : la microscopie électroniques, L'analyse de la distribution de la taille des liposomes au nanosight et des tests de fluorescence. Enfin, l’oligomérisation de la protéine en présence de liposomes a été étudiée.L’ensemble de ces résultats donne les toutes premières informations structurales de cette forme active dimérique de la protéine Alix et confirme son implication dans les processus de remodelage membranaire.
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  • HAL Id : tel-04103459 , version 1

Cite

Nolwenn Miguet. Caractérisation structurale et fonctionnelle de la forme dimérique de la protéine Alix. Biologie structurale [q-bio.BM]. Université Grenoble Alpes [2020-..], 2022. Français. ⟨NNT : 2022GRALV097⟩. ⟨tel-04103459⟩
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