En imagerie nucléaire (scintigraphie, TEMP, TEP), les diagnostics sont fréquemment faits à l'aide des courbes d'activité temporelles des différents organes et tissus étudiés. Ces courbes représentent l'évolution de la distribution d'un traceur radioactif injecté dans le patient. Leur obtention est compliquée par la superposition des organes et des tissus dans les séquences d'images 2D, et il convient donc de séparer les différentes contributions présentes dans les pixels. Le problème de séparation de sources sous-jacent étant sous-déterminé, nous proposons d'y faire face dans cette thèse en exploitant différentes connaissances a priori d'ordre spatial et temporel sur les sources. Les principales connaissances intégrées ici sont les régions d'intérêt (ROI) des sources qui apportent des informations spatiales riches. Contrairement aux travaux antérieurs qui ont une approche binaire, nous intégrons cette connaissance de manière robuste à la méthode de séparation, afin que cette dernière ne soit pas sensible aux variations inter et intra-utilisateurs dans la sélection des ROI. La méthode de séparation générique proposée prend la forme d'une fonctionnelle à minimiser, constituée d'un terme d'attache aux données ainsi que de pénalisations et de relâchements de contraintes exprimant les connaissances a priori. L'étude sur des images de synthèse montrent les bons résultats de notre approche par rapport à l'état de l'art. Deux applications, l'une sur les reins, l'autre sur le cœur illustrent les résultats sur des données cliniques réelles.