Characterization of the bone lacuno-canalicular network using optical microscopy
Caractérisation du réseau lacuno-canaliculaire osseux par microscopie optique
Résumé
This thesis focuses on the study of bone lacuno-canalicular network (LCN) using different optical microscopy techniques. The LCN is the porosity network in the bone matrix where the cellular network lie. It is formed of dendritic cells: the osteocytes which are connected to each other. Although it plays a major role in the formation, remodeling and maintenance of biomechanical properties of bone, only little is known about this network as a whole. This can be explain by the difficult characterization of such a dense and complex network with sub-micron resolution and scales up to the entire organ. In this work we have sought to improve the characterization of the LCN using two approaches: the development of a method to analyse the network on large scale using confocal microscopy on one hand, and the assessment of the potential of non linear microscopy technique to study the LCN on the other hand.First, we have developed a protocol from sample preparation to image processing and data analysis to optimize confocal imaging of bone tissue in order to obtain a quantitative large scale analysis of the network. Preliminary results show a wide variation of network parameters at all scales revealing its complexity. This analysis was then used in order to assess changes in the LCN across an entire mice femur.Secondly, we study the potential of the non-linear optical microscopies especially the third harmonic generation (THG) microscopy for imaging and the study of the LCN. Initially, we demonstrated the ability to visualise the LCN without fluorescent labelling using THG microscopy. From this proof of concept we explained the origin of the different ThG microscopy contrasts observed in bone tissue: a signal from the porosities allowing to visualize the network and a structured background signal generated at the interfaces between collagen fibrils. We also assess the possibilities of combinations between different non-linear signals, mainly THG and SHG (second harmonic generation) that can simultaneously image the network and the collagen matrix respectively. A correlation between the network structure and collagen organization has been established using the visualization of these two signals over large scales. Finally quantitative parameters of the LCN were obtained from THG images and applied to study the effects of microgravity on the cellular network structure.
Cette thèse porte sur l'étude du réseau lacuno-canaliculaire (Lacuno-canalicular Network : LCN) osseux grâce à différentes techniques de microscopie optique. Le LCN correspond à l'empreinte dans la matrice osseuse du réseau ostéocytaire formé de cellules dendritiques (les ostéocytes) interconnectées. Bien qu'il joue un rôle majeur dans la formation, le remodelage et le maintien des propriétés biomécaniques de l'os, les informations sur ce réseau cellulaire dans sa globalité restent limitées. Cela provient notamment de la difficulté à caractériser ce réseau dense et complexeavec une résolution sub-micrométrique sur des échelles allant jusqu'à l'organe entier. Dans cetravail de thèse nous avons cherché à améliorer la caractérisation du LCN en utilisant deux approches : la mise en place d'une méthode d'analyse du LCN à grande échelle à partir dela microscopie confocale d'une part et l'évaluation du potentiel de la microscopienon linéaire pour l'étude du LCN d'autre part.Dans un premier temps nous avons mis au point un protocole allant de la préparation des échantillons jusqu'au traitement des images et à l'analyse des données afin d'optimiser l'imagerie confocale des tissus osseux dans le but d'obtenir une analyse quantitative du réseau à grande échelle. Les résultats préliminaires mettent en évidence une grande variabilité des paramètres du réseau à toutes les échelles révélant la complexité de celui-ci. Cette analyse a été mise en pratique afin d'étudier les variations du LCN à l'échelle d'un fémur entier de souris.Dans un second temps, nous avons évaluer le potentiel de la microscopie optique non linéaire et notamment de la génération de troisième harmonique (THG) pour l'imagerie et l'étude du LCN. Nous avons tout d'abord montré la possibilité de visualiser le LCN, sans marquage fluorescent, grâce à la microscopie THG. A partir de cette preuve de principe nous avons expliqué l'origine des contrastes observés dans l'os par microscopie THG : un signal provenant des porosités et permettant de visualiser le réseau et un signal de fond structuré provenant des interfaces entre les fibrilles de collagène. Nous avons également évaluer les possibilités de la combinaisons de signaux non linéaires, principalement ceux de la THG et de la SHG (génération de seconde harmonique) qui permettent de visualiser simultanément le réseau et la matrice de collagène respectivement. Une corrélation entre la structure du réseau et l'organisation du collagène a pu être établie grâce à la visualisation de ces deux signaux sur de grandes échelles. Enfin des résultats quantitatifs sur le LCN ont pu être obtenus à partir des images THG permettant une étude des effets de la micro-gravité sur la structure de ce réseau.
Domaines
Biophysique [physics.bio-ph]
Origine : Version validée par le jury (STAR)