Détermination des structures de petites protéines par RMN

Abstract : Depuis mon entrée au CNRS en 1992, mon travail de recherche a porté sur les études de protéines par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Au sein du Laboratoire de Résonance Magnétique Nucléaire (LRMN) de l’Institut de Biologie Structurale à Grenoble, mon rôle se situe à l’interface entre la biologie et la RMN. Ainsi, il a été possible d’établir des étroites collaborations entre des chercheurs biochimistes et notre équipe de RMN. Les informations structurales qui ont été obtenues à partir des données RMN fournissent des informations précieuses complétant souvent les études fonctionnelles établies dans les laboratoires de mes collaborateurs. Ma motivation principale consiste donc en l’établissement des liens forts entre la biochimie et la biologie structurale. Avec la cristallographie à rayons X, la RMN est une méthode puissante pour l’obtention de l’information structurale à haute résolution des macromolécules biologiques (protéines, ADN, glucides …). De plus, la RMN est souvent la technique de choix pour accéder à des informations précises sur la dynamique des biomolécules ainsi sur des interactions intermoléculaires. Pendant les dernières quinze années, la RMN a connu des avancées importantes, permettant aujourd’hui l’étude de macromolécules des tailles de plus en plus élevées, approchant les poids moléculaires de 80 kDa. Plusieurs facteurs ont contribué à cette évolution!: L’instrumentation!: l’intensité des champs magnétiques est passée de 2.1 Tesla (fréquence 1H de 90 MHz) à 21 Tesla (fréquence 1H de 900 MHz) ce qui a résulté en une augmentation considérable de la résolution et de la sensibilité de l’expérience RMN. En parallèle, l’utilisation des cryosondes contribue à augmenter le rapport du signal sur bruit d’un facteur 2 à 3, ce qui permet de travailler à des concentrations des échantillons plus faibles et/ou de réduire le temps d’accumulation des expériences. Les développements méthodologiques!: vers la fin des années 1980, les techniques de la RMN hétéronucléaire ont été introduites. Dans ces expériences, l’aimantation est transférée du proton vers un ou plusieurs hétéronoyaux (13C, 15N) pour être à nouveau détecté au niveau du proton. Dans ces expériences, la sensibilité est déterminée par le rapport gyromagnétique important du proton, tandis que le transfert très efficace de l’aimantation et dû au constantes de couplage 1J élevées. De plus, la détection d’un deuxième voire d’un troisième noyau permet d’augmenter la résolution de l’expérience par l’ajout d’une ou plusieurs dimensions supplémentaires. Plus récemment, le développement de la technique TROSY (transverse relaxation optimized spectroscopy), fondée sur l’utilisation constructive de la corrélation croisée entre deux mécanismes de relaxation à champ élevé, permet aujourd’hui des études de macromolécules à haut poids moléculaire (> 50 kDa) par RMN. En ce qui concerne l’obtention des informations structurales, il faut mentionner l’exploitation des paramètres expérimentaux liés à l’orientation d’une interaction donnée par rapport à un système de référence extérieur. Ceci inclut les interactions dues au paramagnétisme des protéines, à leur alignement partiel dans le champ magnétique ou à la relaxation modulée par l’anisotropie de diffusion rotationnelle. Cette information à longue portée est évidemment complémentaire des contraintes structurales classiques (effet Overhauser nucléaire, couplages J) mais devient extrêmement précieuse dans le cas où l’exploitation des données classiques est limitée par la taille de la molécule (dégénérescence des fréquences proton, nombre réduit des protons dans des molécules deutériées, diffusion de spin) ou par sa forme (molécules allongées ou contenant plusieurs domaines). La surexpression et le marquage isotopique des protéines. La RMN hétéronucléaire n’aurait pas pu rencontrer autant de succès, si les techniques de la biologie moléculaire n’avaient pas permis le clonage des gènes et la surexpression des protéines correspondantes dans des organismes appropriés. Il est ainsi devenu possible de produire des protéines enrichies jusqu’à 100% en 15N, 13C et 2H d’une manière aisée. La deutériation des macromolécules devient surtout utile pour des masses moléculaires élevées pour la RMN (> 15 kDa) où elle permet la diminution significative de la relaxation dipolaire. Dans ce document, j’aimerais illustrer les différentes facettes de la RMN appliquée à l’étude de protéines par quelques exemples choisis parmis les projets de recherche accomplis durant ces dernières années par moi-même et également par des étudiants que j’ai encadrés lors de leur séjour doctoral au laboratoire. Les sujets que je vais traiter sont variés, même si plusieurs sont reliés aux métalloprotéines et au transfert d’électrons. Ceci est principalement dû au fait qu’à l’heure actuelle, nous n’avons pas les moyens (personnels et matériels) nécessaires au développement d’une recherche biologique propre au sein du LRMN. Mes projets de recherche sont donc majoritairement nés suite à des discussions avec des chercheurs des laboratoires de biologie ou de biochimie.
Type de document :
HDR
Biologie structurale [q-bio.BM]. Université Joseph Fourier (Grenoble I), 2003
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Contributeur : Frank Thomas <>
Soumis le : lundi 30 janvier 2017 - 09:34:07
Dernière modification le : lundi 19 février 2018 - 14:34:04

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Beate Bersch. Détermination des structures de petites protéines par RMN. Biologie structurale [q-bio.BM]. Université Joseph Fourier (Grenoble I), 2003. 〈tel-01449090〉

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